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【48812】内毒素的别离提取和纯化办法介绍
发布时间:2024-08-09 |   作者: 企鹅电竞网页版网址

  从20世纪30年代至今,依据内毒素的理化性质而规划的别离、判定内毒素的技能办法主要有下述几种:

  Boivin和Messrobeanu于1935年,将活菌或经冷冻枯燥的大肠杆菌,在4℃条件下与0.25N的三氯醋酸一起振动或剧烈拌和,将细菌细胞裂解,使LPS分子从破溃的细胞外膜上游离出来。离心后取上清液经浓缩后,加2倍体积的冷冻乙醇,将生成的沉积物溶解、浓缩后冷冻枯燥,即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌体蛋白,这些蛋白质可影响LPS的理化性质和生物学活性。

  wesphal和luederitz于1952年为别离含蛋白质较低的LPS而树立的办法,今后被大范围的应用于水溶性S-LPS的提取。详细进程为:在细菌的水溶液中,参加等量90%的酚将细胞裂解,使内毒素分子从破溃的细胞外膜上游离出来。68℃,振动10~15min后,冷却、离心,搜集富含LPS的水相,并重复用水萃取3~5次,然后将水相浓缩、冷冻于燥,得到粗提的LPS,将粗制品溶解于水,高速离心(100000g,2~3h),得到颗粒状LPS后再溶于水中冷冻枯燥。此法提取的LPS纯度较高,蛋白质含量为1%~3%。

  由Galanos规划的提取R-LPS的办法。预先经乙醇、丙酮、脱脂后的枯燥菌,用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所组成的混合提取液提取2~3次,取酚相,得到LPS和孔蛋白(porin)提取液,用减压法去除溶媒,加水构成沉积,并洗刷3~5次,然后再用80%苯酚复溶,减压枯燥,得到的LPS粗制品溶于水,超速离心取沉积,即得到LPS纯品。此法纯化得到的LPS,不含核酸和多聚糖,蛋白质含量可控制在1%以下。

  由Morrison等于1975年规划。水-丁醇法较酚法简洁,温文,适用于提取大肠杆菌和沙门菌的LPS;所得制品含蛋白量约1%。但此办法仍存在一些缺乏,因为丁醇不能灭活制品中酶类,导致在制备进程和贮存时,Lipid A常产生降解。

  运用阳离子树脂非特异性的吸顺便负电荷LPS的性质,将LPS从活动相中别离纯化出来。

  运用多粘菌素B特异性结合LPS的特性,将多粘菌素B包被于聚丙烯胺树脂等高分子聚合物的外表,制成特异性结合LPS的层析柱,即可对LPS进行亲和层析法纯化。

  通常情况下,未提纯的LPS溶液中存在许多的小分子带电物质,如Mg2+ 、Ca2+和少数的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等离子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亚精胺及尸胺等小分子量多胺。它们中和LPS分子上带负电荷的磷酸基团,使得本能够用带电荷的吸附剂将LPS除掉的作用显着下降。电透析就是经过离子交流的办法来进行LPS纯化的。其原理是将许多的阴/阳离子交流膜交织地串联在一起,电解质溶液则在膜间活动,两边施加直流电之后溶液中阳离子(如无机阳离子、生物碱等)向阴极移动而阴离子(如无机阴离子、有机酸等)向阳极移动。其间阴离子可顺畅经过阴离子膜,但再往前移动时却被附近的阳离子膜挡住。相同,阳离子也能够顺畅地经过阳离子膜而无法经过阴离子膜。中性化合物及高分子化合物则留在透析液中,终究得到纯化的提取物(图2-6)。

  因为提取的LPS中含有较多带正电荷的杂质,因此在LPS的电透析进程中可发现阴极的pH值升高,阳极的pH值改变不显着的现象。电透析进程中LPS溶液的pH值常有某些特定的程度的下降,一起因为有安稳LPS多聚体功用的Mg2+ 、Ca2+等离子成分被除掉,LPS多聚体变为单体而产生沉积。为防止此现象,需用NaOH或三乙胺将其间和到pH 7.0左右,使其构成中性的、高水溶性的LPS钠盐和LPS三乙胺盐而从头溶解。电透析结束时,LPS一般为酸性产品,此酸性LPS在水中的溶解度极低,可直接进行冻干处理,-4~-20℃低温保存,每次运用前可用不同的碱中和转化成所需求的LPS盐。

  依据LPS与核酸片段在分子量上的差异,可用超速离心法、电泳法等办法将其去除。

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发布时间:2024-08-09

  从20世纪30年代至今,依据内毒素的理化性质而规划的别离、判定内毒素的技能办法主要有下述几种:

  Boivin和Messrobeanu于1935年,将活菌或经冷冻枯燥的大肠杆菌,在4℃条件下与0.25N的三氯醋酸一起振动或剧烈拌和,将细菌细胞裂解,使LPS分子从破溃的细胞外膜上游离出来。离心后取上清液经浓缩后,加2倍体积的冷冻乙醇,将生成的沉积物溶解、浓缩后冷冻枯燥,即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌体蛋白,这些蛋白质可影响LPS的理化性质和生物学活性。

  wesphal和luederitz于1952年为别离含蛋白质较低的LPS而树立的办法,今后被大范围的应用于水溶性S-LPS的提取。详细进程为:在细菌的水溶液中,参加等量90%的酚将细胞裂解,使内毒素分子从破溃的细胞外膜上游离出来。68℃,振动10~15min后,冷却、离心,搜集富含LPS的水相,并重复用水萃取3~5次,然后将水相浓缩、冷冻于燥,得到粗提的LPS,将粗制品溶解于水,高速离心(100000g,2~3h),得到颗粒状LPS后再溶于水中冷冻枯燥。此法提取的LPS纯度较高,蛋白质含量为1%~3%。

  由Galanos规划的提取R-LPS的办法。预先经乙醇、丙酮、脱脂后的枯燥菌,用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所组成的混合提取液提取2~3次,取酚相,得到LPS和孔蛋白(porin)提取液,用减压法去除溶媒,加水构成沉积,并洗刷3~5次,然后再用80%苯酚复溶,减压枯燥,得到的LPS粗制品溶于水,超速离心取沉积,即得到LPS纯品。此法纯化得到的LPS,不含核酸和多聚糖,蛋白质含量可控制在1%以下。

  由Morrison等于1975年规划。水-丁醇法较酚法简洁,温文,适用于提取大肠杆菌和沙门菌的LPS;所得制品含蛋白量约1%。但此办法仍存在一些缺乏,因为丁醇不能灭活制品中酶类,导致在制备进程和贮存时,Lipid A常产生降解。

  运用阳离子树脂非特异性的吸顺便负电荷LPS的性质,将LPS从活动相中别离纯化出来。

  运用多粘菌素B特异性结合LPS的特性,将多粘菌素B包被于聚丙烯胺树脂等高分子聚合物的外表,制成特异性结合LPS的层析柱,即可对LPS进行亲和层析法纯化。

  通常情况下,未提纯的LPS溶液中存在许多的小分子带电物质,如Mg2+ 、Ca2+和少数的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等离子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亚精胺及尸胺等小分子量多胺。它们中和LPS分子上带负电荷的磷酸基团,使得本能够用带电荷的吸附剂将LPS除掉的作用显着下降。电透析就是经过离子交流的办法来进行LPS纯化的。其原理是将许多的阴/阳离子交流膜交织地串联在一起,电解质溶液则在膜间活动,两边施加直流电之后溶液中阳离子(如无机阳离子、生物碱等)向阴极移动而阴离子(如无机阴离子、有机酸等)向阳极移动。其间阴离子可顺畅经过阴离子膜,但再往前移动时却被附近的阳离子膜挡住。相同,阳离子也能够顺畅地经过阳离子膜而无法经过阴离子膜。中性化合物及高分子化合物则留在透析液中,终究得到纯化的提取物(图2-6)。

  因为提取的LPS中含有较多带正电荷的杂质,因此在LPS的电透析进程中可发现阴极的pH值升高,阳极的pH值改变不显着的现象。电透析进程中LPS溶液的pH值常有某些特定的程度的下降,一起因为有安稳LPS多聚体功用的Mg2+ 、Ca2+等离子成分被除掉,LPS多聚体变为单体而产生沉积。为防止此现象,需用NaOH或三乙胺将其间和到pH 7.0左右,使其构成中性的、高水溶性的LPS钠盐和LPS三乙胺盐而从头溶解。电透析结束时,LPS一般为酸性产品,此酸性LPS在水中的溶解度极低,可直接进行冻干处理,-4~-20℃低温保存,每次运用前可用不同的碱中和转化成所需求的LPS盐。

  依据LPS与核酸片段在分子量上的差异,可用超速离心法、电泳法等办法将其去除。

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  从20世纪30年代至今,依据内毒素的理化性质而规划的别离、判定内毒素的技能办法主要有下述几种:

  Boivin和Messrobeanu于1935年,将活菌或经冷冻枯燥的大肠杆菌,在4℃条件下与0.25N的三氯醋酸一起振动或剧烈拌和,将细菌细胞裂解,使LPS分子从破溃的细胞外膜上游离出来。离心后取上清液经浓缩后,加2倍体积的冷冻乙醇,将生成的沉积物溶解、浓缩后冷冻枯燥,即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌体蛋白,这些蛋白质可影响LPS的理化性质和生物学活性。

  wesphal和luederitz于1952年为别离含蛋白质较低的LPS而树立的办法,今后被大范围的应用于水溶性S-LPS的提取。详细进程为:在细菌的水溶液中,参加等量90%的酚将细胞裂解,使内毒素分子从破溃的细胞外膜上游离出来。68℃,振动10~15min后,冷却、离心,搜集富含LPS的水相,并重复用水萃取3~5次,然后将水相浓缩、冷冻于燥,得到粗提的LPS,将粗制品溶解于水,高速离心(100000g,2~3h),得到颗粒状LPS后再溶于水中冷冻枯燥。此法提取的LPS纯度较高,蛋白质含量为1%~3%。

  由Galanos规划的提取R-LPS的办法。预先经乙醇、丙酮、脱脂后的枯燥菌,用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所组成的混合提取液提取2~3次,取酚相,得到LPS和孔蛋白(porin)提取液,用减压法去除溶媒,加水构成沉积,并洗刷3~5次,然后再用80%苯酚复溶,减压枯燥,得到的LPS粗制品溶于水,超速离心取沉积,即得到LPS纯品。此法纯化得到的LPS,不含核酸和多聚糖,蛋白质含量可控制在1%以下。

  由Morrison等于1975年规划。水-丁醇法较酚法简洁,温文,适用于提取大肠杆菌和沙门菌的LPS;所得制品含蛋白量约1%。但此办法仍存在一些缺乏,因为丁醇不能灭活制品中酶类,导致在制备进程和贮存时,Lipid A常产生降解。

  运用阳离子树脂非特异性的吸顺便负电荷LPS的性质,将LPS从活动相中别离纯化出来。

  运用多粘菌素B特异性结合LPS的特性,将多粘菌素B包被于聚丙烯胺树脂等高分子聚合物的外表,制成特异性结合LPS的层析柱,即可对LPS进行亲和层析法纯化。

  通常情况下,未提纯的LPS溶液中存在许多的小分子带电物质,如Mg2+ 、Ca2+和少数的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等离子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亚精胺及尸胺等小分子量多胺。它们中和LPS分子上带负电荷的磷酸基团,使得本能够用带电荷的吸附剂将LPS除掉的作用显着下降。电透析就是经过离子交流的办法来进行LPS纯化的。其原理是将许多的阴/阳离子交流膜交织地串联在一起,电解质溶液则在膜间活动,两边施加直流电之后溶液中阳离子(如无机阳离子、生物碱等)向阴极移动而阴离子(如无机阴离子、有机酸等)向阳极移动。其间阴离子可顺畅经过阴离子膜,但再往前移动时却被附近的阳离子膜挡住。相同,阳离子也能够顺畅地经过阳离子膜而无法经过阴离子膜。中性化合物及高分子化合物则留在透析液中,终究得到纯化的提取物(图2-6)。

  因为提取的LPS中含有较多带正电荷的杂质,因此在LPS的电透析进程中可发现阴极的pH值升高,阳极的pH值改变不显着的现象。电透析进程中LPS溶液的pH值常有某些特定的程度的下降,一起因为有安稳LPS多聚体功用的Mg2+ 、Ca2+等离子成分被除掉,LPS多聚体变为单体而产生沉积。为防止此现象,需用NaOH或三乙胺将其间和到pH 7.0左右,使其构成中性的、高水溶性的LPS钠盐和LPS三乙胺盐而从头溶解。电透析结束时,LPS一般为酸性产品,此酸性LPS在水中的溶解度极低,可直接进行冻干处理,-4~-20℃低温保存,每次运用前可用不同的碱中和转化成所需求的LPS盐。

  依据LPS与核酸片段在分子量上的差异,可用超速离心法、电泳法等办法将其去除。