《食品科学》：江西师范大学沙小梅教授等：核桃主要致敏蛋白Jug r 1的分离纯化、鉴定与分析
发布时间：2024-07-11 | 作者: 企鹅电竞网页版网址
泡核桃（Juglans sigillata）别名胡桃、羌果，为胡桃科胡桃属木本植物，是我国最重要的经济类坚果之一，其可食部位为核桃仁，富含蛋白、氨基酸及不饱和脂肪酸等营养成分，其中蛋白占比可达22.18%。核桃蛋白是一种较为优质的植物蛋白资源，但同时也是世界上主要的食物过敏原之一。截至目前，世界过敏原数据库（）共收录了6 种核桃过敏原的信息，其中Jug r 1是一种分子质量约16.4 kDa的2S蛋白种子贮藏蛋白，由139 个氨基酸组成，是引发核桃过敏反应的主要原因。
西南林业大学生命科学学院的沈明娟、张雪春*和江西师范大学生命科学学院的沙小梅*等以云南不同产地的泡核桃为研究对象，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）等方法，从中筛选出Jug r 1含量最高的品种，进一步采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、液相色谱-串联质谱等手段对Jug r 1进行提取、分离纯化和鉴定，并利用圆二色谱和紫外光谱法对其结构可以进行表征，旨在为深入研究Jug r 1提供科学基础，以期为核桃致敏的诊断、治疗和机理研究提供一定的参考依据。
不同产地核桃蛋白SDS-PAGE如图1A所示，不同产地的核桃蛋白条带分布基本一致，分子质量均在10～75 kDa范围，说明含多种相同的蛋白亚基，即这7 种核桃成分组成较为一致，同源性高。另外，不同产地核桃蛋白彼此间条带明暗略有差异，其中保山隆阳的核桃蛋白条带最多，且在11、17、28 kDa和35 kDa附近颜色较深，条带较宽，说明其蛋白含量较高，种类较多。
双抗夹心ELISA法可以有效用在所有食物中过敏原蛋白的检测，不同产地核桃蛋白Jug r 1含量如图1B所示。核桃中Jug r 1含量为：保山隆阳＞临沧大泡＞昌宁细香＞大理龙佳＞大理娘青＞大理漾濞＞大姚三台，其中，保山隆阳核桃中Jug r 1含量最高，为49.73 ng/L，约为大姚三台核桃的2倍，进一步验证了SDS-PAGE结果 。虽然临沧大泡核桃与保山隆阳相比，二者蛋白中Jug r 1的含量没有显著差别，但根据SDS-PAGE结果来看，保山隆阳产地的蛋白分子质量条带比临沧大泡产地的条带更多、颜色更深，各种蛋白分布的特征更明显，更适合于下一步的观察分析和分离纯化。且保山隆阳为云南核桃主产区，选择该地区的核桃进行研究更有意义。因此选取保山隆阳的核桃进行后续分离纯化。
如图2所示，脱脂核桃粉经Tris-HCl中盐缓冲液提取后，小分子质量条带主要出现在浸提物的上清液中（泳道2），鉴于Jug r 1分子质量在16 kDa附近，故选择上清液进一步硫酸铵分级沉淀。结果显示，硫酸铵饱和度在0%～40%区间的沉淀蛋白主要为大分子质量蛋白（25～75 kDa，泳道3～5），小分子质量蛋白在该区间的条带颜色较浅，随硫酸铵饱和度的增加，饱和度在40%～80%区间（泳道5～6）为小分子质量蛋白集中沉淀区，其条带颜色较深。考虑到饱和度在80%～100%区间的沉淀蛋白中硫酸铵饱和结晶过多，蛋白含量较少，难以收集且影响实验结果。因此，后续选择硫酸铵饱和度为40%～80%区间收集沉淀蛋白。
对40%～80%饱和硫酸铵的沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图3A所示。将符合目标蛋白分子质量范围的凝胶（11～17 kDa左右凝胶，红色标记范围）切下。硫酸铵饱和度为40%～80%区间获得的目标沉淀蛋白经LC-MS/MS鉴定分析，如图3B所示，该区域的凝胶检测出致敏蛋白Jug r 1、Jug r 4、Jug r 6以及其他非致敏蛋白的存在。通过Uniprot蛋白质序列数据库（）对其蛋白含量检索发现，其中致敏蛋白Jug r 1的相对含量最高达到37.70%，占总致敏蛋白含量的76.03%。此外，经LC-MS/MS鉴定和相对定量结果能够准确的看出（图3C和表2），硫酸铵饱和度为40%～80%区间蛋白条带的蛋白数量与丰度较大，质谱所收集到的关键峰以及组分复杂。图3C中标注有出峰时间的均为目标蛋白Jug r 1，其大多分布在在20～30 min附近出峰，当出峰时间在27.0446 min时，目标蛋白Jug r 1相对丰度最高，峰面积最大。由表2能够准确的看出，P93198序列蛋白为致敏蛋白Jug r 1，其相对分子质量达到16.4 kDa，Jug r 1的覆盖率最高达到44%。以上根据结果得出，采用饱和度为40%～80%硫酸铵分级沉淀的方法可较好地初步分离纯化核桃致敏蛋白Jug r 1。
如图4A所示，饱和度区间为40%～80%的粗蛋白液经凝胶层析过滤后，当洗脱时间约为40 min时出现第1个峰，直至240 min左右结束出峰，共计出现6 个洗脱峰，按照出峰顺序标记为F1～F6。除F2外，几乎所有峰的峰高较高，峰形窄而尖，说明分离效果较好。对6 个洗脱峰进行SDS-PAGE分析，结果如图4 B 所示，F1所含蛋白组分较少，且条带颜色较淡；F2、F3蛋白组分冗杂，其分子质量大多分布在在20～75 kDa之间，属于高分子质量蛋白；F4收集的蛋白质组分只有1 条清晰的条带，其分子质量大多分布在在11～17 kDa左右，符合目标蛋白Jug r 1的分子质量范围；F5、F6处的蛋白浓度较低，几乎检测不到蛋白条带。采用Image J软件对凝胶过滤层析后F4组分的SDS-PAGE蛋白条带进行灰度值扫描，结果如图5所示，根据蛋白电泳条带峰面积，计算得到F4组分的蛋白纯度占总蛋白的96.83%。因此，选择F4组分的蛋白进行后续研究。
将F4组分样品经透析除盐、冻干后进行LC-MS/MS检测，其总离子流图如图6所示。经过凝胶过滤层析分离纯化后的目标蛋白Jug r 1与硫酸铵沉淀法初级分离纯化的粗蛋白相比，质谱收集的关键峰组分较少，表明分离纯化之后，目标蛋白Jug r 1纯度提高，其关键出峰时间大多分布在在57 min附近，经数据比对发现，出峰时间分别在56.545、57.579、58.087、58.153 min附近的为目标蛋白Jug r 1。综合表3可知，F4组分的肽段数量单一，丰度较高，其中序列号为P93198的蛋白分值最高，其分子质量为16.373 kDa，氨基酸序列为139，符合Jug r 1的典型特征。此外质谱共检测到14 条肽段，均为对应蛋白质组中的唯一肽段，其中2 条肽段（GEEMEEMVQSAR、QQQQQGLR）为目标蛋白Jug r 1所唯一对应的肽段，总肽段长度最长（100～119），肽段分值最高（表4），故将其鉴定为Jug r 1。其他肽段使用UniProt蛋白质序列数据库（）检索发现，均为非致敏蛋白，其蛋白质类型主要为蛋白组功能、分子功能、生物过程物质，如细胞骨架（A0A834CXD8）、脂肪酸结合（A0A2I4E8T0）、DNA转录（A0A6P9EG14）等。
单因素试验结果如图7A、B所示，Jug r 1的蛋白含量随上样质量浓度的增加呈上升的趋势，但蛋白得率却呈下降趋势，原因主要在于样品质量浓度随着上样质量浓度的增加而增大，而上样体积、洗脱流速保持固定不变，这导致Jug r 1增加的比例远小于样品增加的比例。 综合蛋白吸收信号峰值及目标蛋白Jug r 1得率，选择上样质量浓度为30 mg/mL。 由图7C、D可知，Jug r 1的蛋白吸收信号峰值随上样体积的增加而增大，当上样体积为4 mL时，此时的样品质量浓度最高，Jug r 1含量最高，而Jug r 1得率却与上样体积为3 mL的相比无显著差异（ P ＞0.05），为了更方便检测Jug r 1的蛋白含量，考虑选择上样体积为4 mL。图7A～D结果为，当上样质量浓度与上样体积继续增加时，蛋白吸收信号峰宽会有所增加，致使峰与峰之间分离不彻底，同时对蛋白质的得率无显著提高作用，反而造成蛋白的浪费。
由图7E、F得知，Jug r 1含量和得率随着洗脱流速的增加呈上升后下降的趋势，当洗脱流速为1 mL/min时，Jug r 1含量和得率分别达到最高（P＜0.05）。当洗脱开始后，样品质量浓度随着洗脱流速的增加而增加，此时Jug r 1含量和得率有所上升，但持续增加洗脱流速，洗脱流速过快造成部分样品直接没有分离而被洗脱，导致Jug r 1含量和得率下降。综合而言，过快或过慢的洗脱流速都会降低对Jug r 1分离纯化的效果，故选择洗脱流速为1 mL/min。
综上所述，确定凝胶层析最佳条件为上样质量浓度30 mg/mL、上样体积4 mL、洗脱流速1 mL/min，在此条件下Jug r 1目标蛋白含量和得率最高，分别为19.90 mg/120 mg上样量和16.58%。
过敏原Jug r 1的圆二色谱图及其二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲）的相对含量如图8所示。由图8A所示，过敏原Jug r 1在190～200 nm间有一正谱峰，于195 nm波长处为最大吸收峰，并显示出209 nm和223 nm的双负峰谱带的存在，其中209 nm负峰是α-螺旋肽键的π-π*跃迁所致，223 nm负峰是α-螺旋肽键的n-π*跃迁所致，表明过敏原蛋白Jug r 1明显存在α-螺旋结构。另外，通过圆二色谱在线软件分析得到其二级结构相对含量结果如图8B所示，过敏原Jug r 1的二级结构中α-螺旋相对含量最大为49.89%（P＜0.05），然后依次为无规卷曲（24.50%）、β-转角（17.70%）、β-折叠（7.95%），这说明核桃过敏原Jug r 1以多种构象共存，并以α-螺旋结构为主。目前鲜见过敏原Jug r 1二级结构的报道，因此本实验结果可为核桃过敏原蛋白Jug r 1的后续研究提供一定参考。
采用双抗夹心ELISA法检测核桃蛋白分离纯化前后Jug r 1的含量变化如图9所示，核桃蛋白的Jug r 1含量最低，经40%～80%硫酸铵分级沉淀后，其Jug r 1含量呈显著上升趋势（P＜0.05），最后再经凝胶过滤层析后，Jug r 1的含量最高（16.73 ng/L），明显高于核桃蛋白和硫酸铵分级沉淀蛋白中Jug r 1含量（P＜0.05），说明经过“两步”分离纯化可提高过敏蛋白Jug r 1的含量，为后续深入研究核桃蛋白的致敏性奠定基础。
针对云南不同产地的核桃，筛选出Jug r 1含量最高的保山隆阳产地核桃为原料，对其进行硫酸铵分级沉淀、Superdex 200 pg凝胶过滤层析以分离纯化Jug r 1，并采用SDS-PAGE、ELISA和LC-MS/MS等手段对Jug r 1进行检验确定。在纯化过程中，确定了目标蛋白Jug r 1的最佳硫酸铵沉淀饱和区间以及凝胶过滤层析的最佳条件，“两步”分离纯化可获得蛋白含量为19.90 mg/120 mg上样量、蛋白纯度占总蛋白96%以上的Jug r 1。圆二色谱表明，纯化的Jug r 1以α-螺旋结构为主，双抗夹心ELISA结果为，经“两步”分离纯化后的核桃蛋白中Jug r 1含量显著上升。本研究技术路线简单、设备要求低、耗时短、重复性好，适合实验室少量制备，也可为核桃致敏蛋白Jug r 1后续的相关研究和应用提供科学参考。
沙小梅，女，1987年生，博士，教授，江西师范大学生命科学学院博士生导师，主要是做绿色食物资源的高值化利用研究，尤其是水产品精深加工及副产物综合利用。入选江西省“双千计划”，是国家大宗淡水鱼产业技术体系副产物综合利用岗位、江西省优势科学技术创新团队和江西高校省级示范研究生导师创新团队核心成员，江西省特殊食品技术专家、南昌市金融专家服务团绿色食品产业小组专家。主持国家及省部级项目11 项，参与国家或省部级项目30 项，发表学术论文98 篇（其中SCI论文52 篇，一区SCI论文24 篇），申请国家发明专利49 项（其中授权国家发明专利22 项）。其博士学位论文被评为江西省优秀博士学位论文，作为负责人带领团队参加第一届全国博士后创新创业大赛斩获全国金奖1项，作为第一指导老师带领学生参加中国“互联网+”大学生创新创业大赛荣获全国银奖2 项，获江西省教学成果一等奖1 项、江西省科学技术进步一等奖和二等奖各1 项、全国商业科学技术进步一等奖1 项、教育部科学技术进步二等奖1 项。
张雪春，女，1981年出生，博士，副教授，西南林业大学生命科学学院硕士生导师，主要研究方向为农林资源开发利用、植物蛋白的加工及其性质研究等。入选云南省“兴滇英才支持计划”青年人才，《中国农业科学》期刊青年编委，《河南工业大学学报（自然科学版）》首届青年编委，主持及参与国家自然科学基金、省科技厅、省教育厅项目等10余项，第一作者和通讯作者发表论文30余篇，主编书籍1部，现为Frontiers in Nutrition、ACS Food Science & Technology等学术期刊审稿人。
沈明娟，1997年11月生，现为西南林业大学生命科学学院食品加工与安全专业，全日制硕士研究生。 主要是做核桃、花生等坚果蛋白的结构、加工性质、安全特性等方面的研究，在国内外期刊公开发表学术论文2 篇，以第一作者发表SCI一篇、CSCD一篇。 荣获西南林业大学第八届“互联网+”大学生创新创业大赛校级金奖，云南省大学生市场调研与分析大赛省级三等奖。
本文《核桃主要致敏蛋白Jug r 1的分离纯化、鉴定与分析 》来源于《食品科学》2023年44卷第20期127-135页，作者： 沈明娟， 李云嵌, 杨曦 。 DOI: 10.7506/spkx0408-070 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：陕西师范大学大学食品工程与营养科学学院 赵雯 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及
非热加工专栏：江苏大学邹小波、石吉勇教授等：米糠非热稳定化处理技术探讨研究进展
新闻中心
发布时间：2024-07-11
泡核桃（Juglans sigillata）别名胡桃、羌果，为胡桃科胡桃属木本植物，是我国最重要的经济类坚果之一，其可食部位为核桃仁，富含蛋白、氨基酸及不饱和脂肪酸等营养成分，其中蛋白占比可达22.18%。核桃蛋白是一种较为优质的植物蛋白资源，但同时也是世界上主要的食物过敏原之一。截至目前，世界过敏原数据库（）共收录了6 种核桃过敏原的信息，其中Jug r 1是一种分子质量约16.4 kDa的2S蛋白种子贮藏蛋白，由139 个氨基酸组成，是引发核桃过敏反应的主要原因。
西南林业大学生命科学学院的沈明娟、张雪春*和江西师范大学生命科学学院的沙小梅*等以云南不同产地的泡核桃为研究对象，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）等方法，从中筛选出Jug r 1含量最高的品种，进一步采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、液相色谱-串联质谱等手段对Jug r 1进行提取、分离纯化和鉴定，并利用圆二色谱和紫外光谱法对其结构可以进行表征，旨在为深入研究Jug r 1提供科学基础，以期为核桃致敏的诊断、治疗和机理研究提供一定的参考依据。
不同产地核桃蛋白SDS-PAGE如图1A所示，不同产地的核桃蛋白条带分布基本一致，分子质量均在10～75 kDa范围，说明含多种相同的蛋白亚基，即这7 种核桃成分组成较为一致，同源性高。另外，不同产地核桃蛋白彼此间条带明暗略有差异，其中保山隆阳的核桃蛋白条带最多，且在11、17、28 kDa和35 kDa附近颜色较深，条带较宽，说明其蛋白含量较高，种类较多。
双抗夹心ELISA法可以有效用在所有食物中过敏原蛋白的检测，不同产地核桃蛋白Jug r 1含量如图1B所示。核桃中Jug r 1含量为：保山隆阳＞临沧大泡＞昌宁细香＞大理龙佳＞大理娘青＞大理漾濞＞大姚三台，其中，保山隆阳核桃中Jug r 1含量最高，为49.73 ng/L，约为大姚三台核桃的2倍，进一步验证了SDS-PAGE结果 。虽然临沧大泡核桃与保山隆阳相比，二者蛋白中Jug r 1的含量没有显著差别，但根据SDS-PAGE结果来看，保山隆阳产地的蛋白分子质量条带比临沧大泡产地的条带更多、颜色更深，各种蛋白分布的特征更明显，更适合于下一步的观察分析和分离纯化。且保山隆阳为云南核桃主产区，选择该地区的核桃进行研究更有意义。因此选取保山隆阳的核桃进行后续分离纯化。
如图2所示，脱脂核桃粉经Tris-HCl中盐缓冲液提取后，小分子质量条带主要出现在浸提物的上清液中（泳道2），鉴于Jug r 1分子质量在16 kDa附近，故选择上清液进一步硫酸铵分级沉淀。结果显示，硫酸铵饱和度在0%～40%区间的沉淀蛋白主要为大分子质量蛋白（25～75 kDa，泳道3～5），小分子质量蛋白在该区间的条带颜色较浅，随硫酸铵饱和度的增加，饱和度在40%～80%区间（泳道5～6）为小分子质量蛋白集中沉淀区，其条带颜色较深。考虑到饱和度在80%～100%区间的沉淀蛋白中硫酸铵饱和结晶过多，蛋白含量较少，难以收集且影响实验结果。因此，后续选择硫酸铵饱和度为40%～80%区间收集沉淀蛋白。
对40%～80%饱和硫酸铵的沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图3A所示。将符合目标蛋白分子质量范围的凝胶（11～17 kDa左右凝胶，红色标记范围）切下。硫酸铵饱和度为40%～80%区间获得的目标沉淀蛋白经LC-MS/MS鉴定分析，如图3B所示，该区域的凝胶检测出致敏蛋白Jug r 1、Jug r 4、Jug r 6以及其他非致敏蛋白的存在。通过Uniprot蛋白质序列数据库（）对其蛋白含量检索发现，其中致敏蛋白Jug r 1的相对含量最高达到37.70%，占总致敏蛋白含量的76.03%。此外，经LC-MS/MS鉴定和相对定量结果能够准确的看出（图3C和表2），硫酸铵饱和度为40%～80%区间蛋白条带的蛋白数量与丰度较大，质谱所收集到的关键峰以及组分复杂。图3C中标注有出峰时间的均为目标蛋白Jug r 1，其大多分布在在20～30 min附近出峰，当出峰时间在27.0446 min时，目标蛋白Jug r 1相对丰度最高，峰面积最大。由表2能够准确的看出，P93198序列蛋白为致敏蛋白Jug r 1，其相对分子质量达到16.4 kDa，Jug r 1的覆盖率最高达到44%。以上根据结果得出，采用饱和度为40%～80%硫酸铵分级沉淀的方法可较好地初步分离纯化核桃致敏蛋白Jug r 1。
如图4A所示，饱和度区间为40%～80%的粗蛋白液经凝胶层析过滤后，当洗脱时间约为40 min时出现第1个峰，直至240 min左右结束出峰，共计出现6 个洗脱峰，按照出峰顺序标记为F1～F6。除F2外，几乎所有峰的峰高较高，峰形窄而尖，说明分离效果较好。对6 个洗脱峰进行SDS-PAGE分析，结果如图4 B 所示，F1所含蛋白组分较少，且条带颜色较淡；F2、F3蛋白组分冗杂，其分子质量大多分布在在20～75 kDa之间，属于高分子质量蛋白；F4收集的蛋白质组分只有1 条清晰的条带，其分子质量大多分布在在11～17 kDa左右，符合目标蛋白Jug r 1的分子质量范围；F5、F6处的蛋白浓度较低，几乎检测不到蛋白条带。采用Image J软件对凝胶过滤层析后F4组分的SDS-PAGE蛋白条带进行灰度值扫描，结果如图5所示，根据蛋白电泳条带峰面积，计算得到F4组分的蛋白纯度占总蛋白的96.83%。因此，选择F4组分的蛋白进行后续研究。
将F4组分样品经透析除盐、冻干后进行LC-MS/MS检测，其总离子流图如图6所示。经过凝胶过滤层析分离纯化后的目标蛋白Jug r 1与硫酸铵沉淀法初级分离纯化的粗蛋白相比，质谱收集的关键峰组分较少，表明分离纯化之后，目标蛋白Jug r 1纯度提高，其关键出峰时间大多分布在在57 min附近，经数据比对发现，出峰时间分别在56.545、57.579、58.087、58.153 min附近的为目标蛋白Jug r 1。综合表3可知，F4组分的肽段数量单一，丰度较高，其中序列号为P93198的蛋白分值最高，其分子质量为16.373 kDa，氨基酸序列为139，符合Jug r 1的典型特征。此外质谱共检测到14 条肽段，均为对应蛋白质组中的唯一肽段，其中2 条肽段（GEEMEEMVQSAR、QQQQQGLR）为目标蛋白Jug r 1所唯一对应的肽段，总肽段长度最长（100～119），肽段分值最高（表4），故将其鉴定为Jug r 1。其他肽段使用UniProt蛋白质序列数据库（）检索发现，均为非致敏蛋白，其蛋白质类型主要为蛋白组功能、分子功能、生物过程物质，如细胞骨架（A0A834CXD8）、脂肪酸结合（A0A2I4E8T0）、DNA转录（A0A6P9EG14）等。
单因素试验结果如图7A、B所示，Jug r 1的蛋白含量随上样质量浓度的增加呈上升的趋势，但蛋白得率却呈下降趋势，原因主要在于样品质量浓度随着上样质量浓度的增加而增大，而上样体积、洗脱流速保持固定不变，这导致Jug r 1增加的比例远小于样品增加的比例。 综合蛋白吸收信号峰值及目标蛋白Jug r 1得率，选择上样质量浓度为30 mg/mL。 由图7C、D可知，Jug r 1的蛋白吸收信号峰值随上样体积的增加而增大，当上样体积为4 mL时，此时的样品质量浓度最高，Jug r 1含量最高，而Jug r 1得率却与上样体积为3 mL的相比无显著差异（ P ＞0.05），为了更方便检测Jug r 1的蛋白含量，考虑选择上样体积为4 mL。图7A～D结果为，当上样质量浓度与上样体积继续增加时，蛋白吸收信号峰宽会有所增加，致使峰与峰之间分离不彻底，同时对蛋白质的得率无显著提高作用，反而造成蛋白的浪费。
由图7E、F得知，Jug r 1含量和得率随着洗脱流速的增加呈上升后下降的趋势，当洗脱流速为1 mL/min时，Jug r 1含量和得率分别达到最高（P＜0.05）。当洗脱开始后，样品质量浓度随着洗脱流速的增加而增加，此时Jug r 1含量和得率有所上升，但持续增加洗脱流速，洗脱流速过快造成部分样品直接没有分离而被洗脱，导致Jug r 1含量和得率下降。综合而言，过快或过慢的洗脱流速都会降低对Jug r 1分离纯化的效果，故选择洗脱流速为1 mL/min。
综上所述，确定凝胶层析最佳条件为上样质量浓度30 mg/mL、上样体积4 mL、洗脱流速1 mL/min，在此条件下Jug r 1目标蛋白含量和得率最高，分别为19.90 mg/120 mg上样量和16.58%。
过敏原Jug r 1的圆二色谱图及其二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲）的相对含量如图8所示。由图8A所示，过敏原Jug r 1在190～200 nm间有一正谱峰，于195 nm波长处为最大吸收峰，并显示出209 nm和223 nm的双负峰谱带的存在，其中209 nm负峰是α-螺旋肽键的π-π*跃迁所致，223 nm负峰是α-螺旋肽键的n-π*跃迁所致，表明过敏原蛋白Jug r 1明显存在α-螺旋结构。另外，通过圆二色谱在线软件分析得到其二级结构相对含量结果如图8B所示，过敏原Jug r 1的二级结构中α-螺旋相对含量最大为49.89%（P＜0.05），然后依次为无规卷曲（24.50%）、β-转角（17.70%）、β-折叠（7.95%），这说明核桃过敏原Jug r 1以多种构象共存，并以α-螺旋结构为主。目前鲜见过敏原Jug r 1二级结构的报道，因此本实验结果可为核桃过敏原蛋白Jug r 1的后续研究提供一定参考。
采用双抗夹心ELISA法检测核桃蛋白分离纯化前后Jug r 1的含量变化如图9所示，核桃蛋白的Jug r 1含量最低，经40%～80%硫酸铵分级沉淀后，其Jug r 1含量呈显著上升趋势（P＜0.05），最后再经凝胶过滤层析后，Jug r 1的含量最高（16.73 ng/L），明显高于核桃蛋白和硫酸铵分级沉淀蛋白中Jug r 1含量（P＜0.05），说明经过“两步”分离纯化可提高过敏蛋白Jug r 1的含量，为后续深入研究核桃蛋白的致敏性奠定基础。
针对云南不同产地的核桃，筛选出Jug r 1含量最高的保山隆阳产地核桃为原料，对其进行硫酸铵分级沉淀、Superdex 200 pg凝胶过滤层析以分离纯化Jug r 1，并采用SDS-PAGE、ELISA和LC-MS/MS等手段对Jug r 1进行检验确定。在纯化过程中，确定了目标蛋白Jug r 1的最佳硫酸铵沉淀饱和区间以及凝胶过滤层析的最佳条件，“两步”分离纯化可获得蛋白含量为19.90 mg/120 mg上样量、蛋白纯度占总蛋白96%以上的Jug r 1。圆二色谱表明，纯化的Jug r 1以α-螺旋结构为主，双抗夹心ELISA结果为，经“两步”分离纯化后的核桃蛋白中Jug r 1含量显著上升。本研究技术路线简单、设备要求低、耗时短、重复性好，适合实验室少量制备，也可为核桃致敏蛋白Jug r 1后续的相关研究和应用提供科学参考。
沙小梅，女，1987年生，博士，教授，江西师范大学生命科学学院博士生导师，主要是做绿色食物资源的高值化利用研究，尤其是水产品精深加工及副产物综合利用。入选江西省“双千计划”，是国家大宗淡水鱼产业技术体系副产物综合利用岗位、江西省优势科学技术创新团队和江西高校省级示范研究生导师创新团队核心成员，江西省特殊食品技术专家、南昌市金融专家服务团绿色食品产业小组专家。主持国家及省部级项目11 项，参与国家或省部级项目30 项，发表学术论文98 篇（其中SCI论文52 篇，一区SCI论文24 篇），申请国家发明专利49 项（其中授权国家发明专利22 项）。其博士学位论文被评为江西省优秀博士学位论文，作为负责人带领团队参加第一届全国博士后创新创业大赛斩获全国金奖1项，作为第一指导老师带领学生参加中国“互联网+”大学生创新创业大赛荣获全国银奖2 项，获江西省教学成果一等奖1 项、江西省科学技术进步一等奖和二等奖各1 项、全国商业科学技术进步一等奖1 项、教育部科学技术进步二等奖1 项。
张雪春，女，1981年出生，博士，副教授，西南林业大学生命科学学院硕士生导师，主要研究方向为农林资源开发利用、植物蛋白的加工及其性质研究等。入选云南省“兴滇英才支持计划”青年人才，《中国农业科学》期刊青年编委，《河南工业大学学报（自然科学版）》首届青年编委，主持及参与国家自然科学基金、省科技厅、省教育厅项目等10余项，第一作者和通讯作者发表论文30余篇，主编书籍1部，现为Frontiers in Nutrition、ACS Food Science & Technology等学术期刊审稿人。
沈明娟，1997年11月生，现为西南林业大学生命科学学院食品加工与安全专业，全日制硕士研究生。 主要是做核桃、花生等坚果蛋白的结构、加工性质、安全特性等方面的研究，在国内外期刊公开发表学术论文2 篇，以第一作者发表SCI一篇、CSCD一篇。 荣获西南林业大学第八届“互联网+”大学生创新创业大赛校级金奖，云南省大学生市场调研与分析大赛省级三等奖。
本文《核桃主要致敏蛋白Jug r 1的分离纯化、鉴定与分析 》来源于《食品科学》2023年44卷第20期127-135页，作者： 沈明娟， 李云嵌, 杨曦 。 DOI: 10.7506/spkx0408-070 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：陕西师范大学大学食品工程与营养科学学院 赵雯 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及
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发布时间：2024-07-11
泡核桃（Juglans sigillata）别名胡桃、羌果，为胡桃科胡桃属木本植物，是我国最重要的经济类坚果之一，其可食部位为核桃仁，富含蛋白、氨基酸及不饱和脂肪酸等营养成分，其中蛋白占比可达22.18%。核桃蛋白是一种较为优质的植物蛋白资源，但同时也是世界上主要的食物过敏原之一。截至目前，世界过敏原数据库（）共收录了6 种核桃过敏原的信息，其中Jug r 1是一种分子质量约16.4 kDa的2S蛋白种子贮藏蛋白，由139 个氨基酸组成，是引发核桃过敏反应的主要原因。
西南林业大学生命科学学院的沈明娟、张雪春*和江西师范大学生命科学学院的沙小梅*等以云南不同产地的泡核桃为研究对象，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）等方法，从中筛选出Jug r 1含量最高的品种，进一步采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、液相色谱-串联质谱等手段对Jug r 1进行提取、分离纯化和鉴定，并利用圆二色谱和紫外光谱法对其结构可以进行表征，旨在为深入研究Jug r 1提供科学基础，以期为核桃致敏的诊断、治疗和机理研究提供一定的参考依据。
不同产地核桃蛋白SDS-PAGE如图1A所示，不同产地的核桃蛋白条带分布基本一致，分子质量均在10～75 kDa范围，说明含多种相同的蛋白亚基，即这7 种核桃成分组成较为一致，同源性高。另外，不同产地核桃蛋白彼此间条带明暗略有差异，其中保山隆阳的核桃蛋白条带最多，且在11、17、28 kDa和35 kDa附近颜色较深，条带较宽，说明其蛋白含量较高，种类较多。
双抗夹心ELISA法可以有效用在所有食物中过敏原蛋白的检测，不同产地核桃蛋白Jug r 1含量如图1B所示。核桃中Jug r 1含量为：保山隆阳＞临沧大泡＞昌宁细香＞大理龙佳＞大理娘青＞大理漾濞＞大姚三台，其中，保山隆阳核桃中Jug r 1含量最高，为49.73 ng/L，约为大姚三台核桃的2倍，进一步验证了SDS-PAGE结果 。虽然临沧大泡核桃与保山隆阳相比，二者蛋白中Jug r 1的含量没有显著差别，但根据SDS-PAGE结果来看，保山隆阳产地的蛋白分子质量条带比临沧大泡产地的条带更多、颜色更深，各种蛋白分布的特征更明显，更适合于下一步的观察分析和分离纯化。且保山隆阳为云南核桃主产区，选择该地区的核桃进行研究更有意义。因此选取保山隆阳的核桃进行后续分离纯化。
如图2所示，脱脂核桃粉经Tris-HCl中盐缓冲液提取后，小分子质量条带主要出现在浸提物的上清液中（泳道2），鉴于Jug r 1分子质量在16 kDa附近，故选择上清液进一步硫酸铵分级沉淀。结果显示，硫酸铵饱和度在0%～40%区间的沉淀蛋白主要为大分子质量蛋白（25～75 kDa，泳道3～5），小分子质量蛋白在该区间的条带颜色较浅，随硫酸铵饱和度的增加，饱和度在40%～80%区间（泳道5～6）为小分子质量蛋白集中沉淀区，其条带颜色较深。考虑到饱和度在80%～100%区间的沉淀蛋白中硫酸铵饱和结晶过多，蛋白含量较少，难以收集且影响实验结果。因此，后续选择硫酸铵饱和度为40%～80%区间收集沉淀蛋白。
对40%～80%饱和硫酸铵的沉淀进行SDS-PAGE分析，结果如图3A所示。将符合目标蛋白分子质量范围的凝胶（11～17 kDa左右凝胶，红色标记范围）切下。硫酸铵饱和度为40%～80%区间获得的目标沉淀蛋白经LC-MS/MS鉴定分析，如图3B所示，该区域的凝胶检测出致敏蛋白Jug r 1、Jug r 4、Jug r 6以及其他非致敏蛋白的存在。通过Uniprot蛋白质序列数据库（）对其蛋白含量检索发现，其中致敏蛋白Jug r 1的相对含量最高达到37.70%，占总致敏蛋白含量的76.03%。此外，经LC-MS/MS鉴定和相对定量结果能够准确的看出（图3C和表2），硫酸铵饱和度为40%～80%区间蛋白条带的蛋白数量与丰度较大，质谱所收集到的关键峰以及组分复杂。图3C中标注有出峰时间的均为目标蛋白Jug r 1，其大多分布在在20～30 min附近出峰，当出峰时间在27.0446 min时，目标蛋白Jug r 1相对丰度最高，峰面积最大。由表2能够准确的看出，P93198序列蛋白为致敏蛋白Jug r 1，其相对分子质量达到16.4 kDa，Jug r 1的覆盖率最高达到44%。以上根据结果得出，采用饱和度为40%～80%硫酸铵分级沉淀的方法可较好地初步分离纯化核桃致敏蛋白Jug r 1。
如图4A所示，饱和度区间为40%～80%的粗蛋白液经凝胶层析过滤后，当洗脱时间约为40 min时出现第1个峰，直至240 min左右结束出峰，共计出现6 个洗脱峰，按照出峰顺序标记为F1～F6。除F2外，几乎所有峰的峰高较高，峰形窄而尖，说明分离效果较好。对6 个洗脱峰进行SDS-PAGE分析，结果如图4 B 所示，F1所含蛋白组分较少，且条带颜色较淡；F2、F3蛋白组分冗杂，其分子质量大多分布在在20～75 kDa之间，属于高分子质量蛋白；F4收集的蛋白质组分只有1 条清晰的条带，其分子质量大多分布在在11～17 kDa左右，符合目标蛋白Jug r 1的分子质量范围；F5、F6处的蛋白浓度较低，几乎检测不到蛋白条带。采用Image J软件对凝胶过滤层析后F4组分的SDS-PAGE蛋白条带进行灰度值扫描，结果如图5所示，根据蛋白电泳条带峰面积，计算得到F4组分的蛋白纯度占总蛋白的96.83%。因此，选择F4组分的蛋白进行后续研究。
将F4组分样品经透析除盐、冻干后进行LC-MS/MS检测，其总离子流图如图6所示。经过凝胶过滤层析分离纯化后的目标蛋白Jug r 1与硫酸铵沉淀法初级分离纯化的粗蛋白相比，质谱收集的关键峰组分较少，表明分离纯化之后，目标蛋白Jug r 1纯度提高，其关键出峰时间大多分布在在57 min附近，经数据比对发现，出峰时间分别在56.545、57.579、58.087、58.153 min附近的为目标蛋白Jug r 1。综合表3可知，F4组分的肽段数量单一，丰度较高，其中序列号为P93198的蛋白分值最高，其分子质量为16.373 kDa，氨基酸序列为139，符合Jug r 1的典型特征。此外质谱共检测到14 条肽段，均为对应蛋白质组中的唯一肽段，其中2 条肽段（GEEMEEMVQSAR、QQQQQGLR）为目标蛋白Jug r 1所唯一对应的肽段，总肽段长度最长（100～119），肽段分值最高（表4），故将其鉴定为Jug r 1。其他肽段使用UniProt蛋白质序列数据库（）检索发现，均为非致敏蛋白，其蛋白质类型主要为蛋白组功能、分子功能、生物过程物质，如细胞骨架（A0A834CXD8）、脂肪酸结合（A0A2I4E8T0）、DNA转录（A0A6P9EG14）等。
单因素试验结果如图7A、B所示，Jug r 1的蛋白含量随上样质量浓度的增加呈上升的趋势，但蛋白得率却呈下降趋势，原因主要在于样品质量浓度随着上样质量浓度的增加而增大，而上样体积、洗脱流速保持固定不变，这导致Jug r 1增加的比例远小于样品增加的比例。 综合蛋白吸收信号峰值及目标蛋白Jug r 1得率，选择上样质量浓度为30 mg/mL。 由图7C、D可知，Jug r 1的蛋白吸收信号峰值随上样体积的增加而增大，当上样体积为4 mL时，此时的样品质量浓度最高，Jug r 1含量最高，而Jug r 1得率却与上样体积为3 mL的相比无显著差异（ P ＞0.05），为了更方便检测Jug r 1的蛋白含量，考虑选择上样体积为4 mL。图7A～D结果为，当上样质量浓度与上样体积继续增加时，蛋白吸收信号峰宽会有所增加，致使峰与峰之间分离不彻底，同时对蛋白质的得率无显著提高作用，反而造成蛋白的浪费。
由图7E、F得知，Jug r 1含量和得率随着洗脱流速的增加呈上升后下降的趋势，当洗脱流速为1 mL/min时，Jug r 1含量和得率分别达到最高（P＜0.05）。当洗脱开始后，样品质量浓度随着洗脱流速的增加而增加，此时Jug r 1含量和得率有所上升，但持续增加洗脱流速，洗脱流速过快造成部分样品直接没有分离而被洗脱，导致Jug r 1含量和得率下降。综合而言，过快或过慢的洗脱流速都会降低对Jug r 1分离纯化的效果，故选择洗脱流速为1 mL/min。
综上所述，确定凝胶层析最佳条件为上样质量浓度30 mg/mL、上样体积4 mL、洗脱流速1 mL/min，在此条件下Jug r 1目标蛋白含量和得率最高，分别为19.90 mg/120 mg上样量和16.58%。
过敏原Jug r 1的圆二色谱图及其二级结构（α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲）的相对含量如图8所示。由图8A所示，过敏原Jug r 1在190～200 nm间有一正谱峰，于195 nm波长处为最大吸收峰，并显示出209 nm和223 nm的双负峰谱带的存在，其中209 nm负峰是α-螺旋肽键的π-π*跃迁所致，223 nm负峰是α-螺旋肽键的n-π*跃迁所致，表明过敏原蛋白Jug r 1明显存在α-螺旋结构。另外，通过圆二色谱在线软件分析得到其二级结构相对含量结果如图8B所示，过敏原Jug r 1的二级结构中α-螺旋相对含量最大为49.89%（P＜0.05），然后依次为无规卷曲（24.50%）、β-转角（17.70%）、β-折叠（7.95%），这说明核桃过敏原Jug r 1以多种构象共存，并以α-螺旋结构为主。目前鲜见过敏原Jug r 1二级结构的报道，因此本实验结果可为核桃过敏原蛋白Jug r 1的后续研究提供一定参考。
采用双抗夹心ELISA法检测核桃蛋白分离纯化前后Jug r 1的含量变化如图9所示，核桃蛋白的Jug r 1含量最低，经40%～80%硫酸铵分级沉淀后，其Jug r 1含量呈显著上升趋势（P＜0.05），最后再经凝胶过滤层析后，Jug r 1的含量最高（16.73 ng/L），明显高于核桃蛋白和硫酸铵分级沉淀蛋白中Jug r 1含量（P＜0.05），说明经过“两步”分离纯化可提高过敏蛋白Jug r 1的含量，为后续深入研究核桃蛋白的致敏性奠定基础。
针对云南不同产地的核桃，筛选出Jug r 1含量最高的保山隆阳产地核桃为原料，对其进行硫酸铵分级沉淀、Superdex 200 pg凝胶过滤层析以分离纯化Jug r 1，并采用SDS-PAGE、ELISA和LC-MS/MS等手段对Jug r 1进行检验确定。在纯化过程中，确定了目标蛋白Jug r 1的最佳硫酸铵沉淀饱和区间以及凝胶过滤层析的最佳条件，“两步”分离纯化可获得蛋白含量为19.90 mg/120 mg上样量、蛋白纯度占总蛋白96%以上的Jug r 1。圆二色谱表明，纯化的Jug r 1以α-螺旋结构为主，双抗夹心ELISA结果为，经“两步”分离纯化后的核桃蛋白中Jug r 1含量显著上升。本研究技术路线简单、设备要求低、耗时短、重复性好，适合实验室少量制备，也可为核桃致敏蛋白Jug r 1后续的相关研究和应用提供科学参考。
沙小梅，女，1987年生，博士，教授，江西师范大学生命科学学院博士生导师，主要是做绿色食物资源的高值化利用研究，尤其是水产品精深加工及副产物综合利用。入选江西省“双千计划”，是国家大宗淡水鱼产业技术体系副产物综合利用岗位、江西省优势科学技术创新团队和江西高校省级示范研究生导师创新团队核心成员，江西省特殊食品技术专家、南昌市金融专家服务团绿色食品产业小组专家。主持国家及省部级项目11 项，参与国家或省部级项目30 项，发表学术论文98 篇（其中SCI论文52 篇，一区SCI论文24 篇），申请国家发明专利49 项（其中授权国家发明专利22 项）。其博士学位论文被评为江西省优秀博士学位论文，作为负责人带领团队参加第一届全国博士后创新创业大赛斩获全国金奖1项，作为第一指导老师带领学生参加中国“互联网+”大学生创新创业大赛荣获全国银奖2 项，获江西省教学成果一等奖1 项、江西省科学技术进步一等奖和二等奖各1 项、全国商业科学技术进步一等奖1 项、教育部科学技术进步二等奖1 项。
张雪春，女，1981年出生，博士，副教授，西南林业大学生命科学学院硕士生导师，主要研究方向为农林资源开发利用、植物蛋白的加工及其性质研究等。入选云南省“兴滇英才支持计划”青年人才，《中国农业科学》期刊青年编委，《河南工业大学学报（自然科学版）》首届青年编委，主持及参与国家自然科学基金、省科技厅、省教育厅项目等10余项，第一作者和通讯作者发表论文30余篇，主编书籍1部，现为Frontiers in Nutrition、ACS Food Science & Technology等学术期刊审稿人。
沈明娟，1997年11月生，现为西南林业大学生命科学学院食品加工与安全专业，全日制硕士研究生。 主要是做核桃、花生等坚果蛋白的结构、加工性质、安全特性等方面的研究，在国内外期刊公开发表学术论文2 篇，以第一作者发表SCI一篇、CSCD一篇。 荣获西南林业大学第八届“互联网+”大学生创新创业大赛校级金奖，云南省大学生市场调研与分析大赛省级三等奖。
本文《核桃主要致敏蛋白Jug r 1的分离纯化、鉴定与分析 》来源于《食品科学》2023年44卷第20期127-135页，作者： 沈明娟， 李云嵌, 杨曦 。 DOI: 10.7506/spkx0408-070 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：陕西师范大学大学食品工程与营养科学学院 赵雯 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及
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